參照菌株的獲取、活化與確認

實驗室為了進行檢驗質量控制、檢驗方法的驗證、確認滅菌效果、培養基或其他生物試劑性能確認等方面的工作，都需要用到一定量的標準菌株。按照中國實驗室國家認可委員會zhi定的檢測和校準實驗室認可準則(CNAL/AC01)中關于標準物質的規定，微生物標準物質應嚴格其保存、使用、管理及確認程序。微生物標準菌株的保存、使用和管理是微生物實驗室的一項重要工作。

獲取
實驗室標準菌株可以通過購買、交換、接受贈送等途徑獲得。實驗室自行分離的菌株對圖標準菌株經過鑒定后，可以做為參考菌株(參考培養物， reference cultures)在實驗室內使用。
標準菌株的源頭是專門的菌種保藏機構的菌株，如ATCC (American Type Culture Collection美國典型培養物保藏中心)的菌株、其他國外quan威菌種保藏機構或我國國家菌種庫儲存的各級標準菌株等。
需要注意，商業來源的菌株是演化菌株(派生菌株),并不是原代菌株，例如：商業ATCC菌株都是派生菌株。保藏中心提供的菌都有固定的編號（菌株號)。
通常菌株編號由兩部分組成：前面是幾個字母的縮寫代表菌種保藏機構，后面緊跟一串數字表明其編號。

活化
從菌種保藏中心購買的菌種一般是安瓿瓶裝的凍干粉劑，近來又出現了幾種新的菌種保藏方式，如： MAST CRYOBANK菌種保藏管、LyfoCults Plus菌種保藏系統、Culti -Loops菌種保藏系統等。
參照隨附的菌種使用活化方法進行活化。商品化的保藏菌株須按照廠商的說明進行，對于有特殊條件要求的菌株尤其要按照推薦的方法執行。
根據GB 19489 《實驗室生物安全通用要求規定》，病原微生物分為I級~N級危害等級。實驗室在符合相應生物安全水平的條件下，進行菌種活化，一定要做好防護。食品微生物實驗室一般只需儲存危害等級I、II級的微生物，高危害等級的微生物不應在食品微生物實驗室保存。

(一)外包裝的開啟
從保藏中心購買的菌株通常有三層包裝。內層(如安瓿瓶)是用于盛放微生物，*密閉，外面用吸水材料包裹，泄漏時起吸附作用。中間層是用塑料罐、泡沫塑料等制成的，對內層起支撐保護作用，該層可以裝數個內層容器，兩者之間有填充填料。外層是硬紙板箱、木箱、塑料箱等制成的，用于保護內包裝。
包裝開啟先要根據菌種所需的防護水平，穿防護服，帶好手套、kou罩、帽子，然后檢查菌種包裝外觀，仔細看有無滲漏、破損等異常現象。檢查無異常后將外包裝除去，依次檢查中間層、內層，直至*打開。
若發現內外層包裝都有破損滲漏現象，并且安瓿瓶等微生物容器已經破損，要立刻通知有關部門和菌種發放單位，對包裝、運輸工具等微生物污染物進行消毒。若外包裝有破損等異常情況，但安瓿瓶等微生物容器無破損，或安瓿瓶等微生物容器已破損，但外包裝無破損、滲漏情況，則無需溯源。對安瓿瓶等微生物容器無破損，按要求開啟；對安瓿瓶等微生物容器已破損，可按照生物安全操作原則，對微生物污染物進行消毒滅菌處理。

(二)安瓶瓶的開啟及菌種復活
檢查完好無損的安瓶瓶可以開啟，一般按下面方法打開內層包裝，取菌種。
單瓶安瓶瓶，先用75%酒精棉擦拭安瓶瓶上部，再用砂輪在安瓿瓶上部橫向銼一道痕跡，然后將劃痕處向外，用無菌脫脂棉包住安瓿瓶(保護雙手),手持安瓿瓶從銼痕處稍向外用力打開安瓶瓶。還可采用將安瓿管頂部燒熱，滴上幾滴無菌冷水或用無菌棉簽沾冷水在頂部擦一擦，頂部出現裂紋，用消毒鑷子輕叩一下，敲下安瓿管的頂端。

雙瓶安剖瓶先把外瓶的頂端燒熱，再在頂端滴幾滴冷水，使頂端玻璃出現裂紋，用鑷子等敲掉頂端，最后用消毒鑷子取出絕緣層和閃瓶。
選擇合適的培養基和培養條件(根據生產商說明)進行復活。凍干菌株的傳代次數不得超過5代，從菌種保藏中心購買的凍干菌種為第0代。

細菌的復活方法：用無菌吸管(或移液器)吸0.5 mL液體培養基加到凍干菌塊上，吹打制成菌懸液。將全部菌懸液移入5ml合適的肉湯培養基中。將管中殘留的幾滴懸液移種到斜面上。在合適的條件下培養，細菌培養溫度通常為25℃或37℃。多數凍干菌株會在幾天后長出，但是少數菌會表現出延滯期延長的現象，需要將正常培養時間加倍。
霉菌和酵母菌的復活方法：用無菌吸管(或移液器)吸0.5 ml-1 ml無菌水到凍干菌塊上，將全部內容物移入裝有5mL無菌水的試管中進行復水，2h (或過夜)后接種到肉湯或固體瓊脂上，在合適的溫度下培養，真菌培養溫度通常是25℃。少數培養物會表現出延滯期延長的現象，需要將正常培養時間加倍。如菌株在推薦的條件下培養不生長，須滅菌處理之后方可丟棄。

(三) MAST CRYOBANK菌種保藏管的使用
MAST CRYOBANK菌種保藏管是由冰凍小管組成的多功能保藏系統，每支小管中包含20-25粒覆有特殊低溫防腐溶液且經過化學處理的珠子。菌種保藏時，只需將經純化培養培養生長旺盛的菌株接入保藏管溶液中，通常需要4~7環，苛養菌要多接一些，擰緊蓋子充分震蕩，細菌即吸附在小珠子上，再用無菌吸管吸走溶液，放入冰箱保藏， -70℃可保存10年，-15 ℃~-10℃可保存1年~3年。
菌種的活化只需將小珠放在合適的瓊脂平板上滾動或置于肉湯中培養即可。

(四) LyfoCcults Plus菌種保藏系統
LyfoCcults Plus菌種保藏系統是一個集儲存、復溶和接種于一體的系統。形狀像鋼筆，使用方便。使用時只需撕開鋁箔袋，取出LyfoCults Plus裝置，旋開一端，取出接種棒，用力擠捏另一端的塑料安剖瓶的液體，混勻后流入帶干粉狀菌小管中，用接種棒在小管中攪動，使菌復溶形成菌懸液，用接種棒蘸兩滴菌液接種到培養基上，涂抹均勻后進行培養復蘇。
菌種保藏系統的使用見。
(1)從箔片包裝上揭下預先打印好的標簽，貼在要接種的培養基上。
(3)撕開安全密封條。
(4)旋開小管上的敷抹器，打開系統。
(5)用力擠壓安瓿瓶，使所有的液體化合物倒進小管中。
(6)混勻。
(7)把小管的頂部作為移液管，在培養基上滴兩滴菌懸液。
(8)用小管的jian端在培養基上劃線。

(五) Culti-Loops菌種保藏系統
Culti-Loops菌種保藏系統是一種接種環形式的菌種保藏系統，接種環上有少量的菌，無需制備，可直接在平板上劃線進行活化，每個接種環可接5塊平板。此保藏系統除彎曲菌需冷凍保存（-18℃）外，其他只需2℃~8℃保存。

(六)實驗室其他方法保藏菌株的復活
實驗室內采用其他方法保藏的菌種復活時可按不同的方法。如在超低溫冰箱中的菌種，復活時，只需取出冷凍菌種的小管，在室溫下融化后接種在適宜的培養基中培養即可。液體石蠟法、沙土管保藏法、半固體穿刺保藏法保藏的，用接種環挑取即可。


確認
菌種確認可從菌落形態，細胞形態，芽孢大小、位置、形狀，生化鑒定等方面進行。
(一)菌落形態
取復活后的菌，在相應的鑒別平板或普通非選擇性平板上劃線分離，培養出單菌落，觀察菌落形態是否符合，同一平板上的單菌落的大小、形狀、顏色、質地、光澤等是否相似；對于出現兩種或以上形態的菌株，應再分別挑取單菌落劃線或稀釋涂布培養，檢測是否重復出現相同特征。
(二)細胞形態
對數生長期的培養物革蘭氏等染色反應應呈現一致性，細胞形狀、大小、鞭毛、莢膜等特征應相似。
(三)芽孢
形成芽孢的菌種，其芽孢大小、位置、形狀應相似。
(四)生化鑒定
必要時進行生化鑒定等實驗，進一步確認。
在菌種確認過程中，如發現菌種有污染，則要分離挑選目標菌株，培養成功后將污染培養物高壓滅菌處理。